Terapia Genica

Trascrizione di un Articolo pubblicato sul numero Marzo 2005 del Periodico "Il Rosso & il Bianco", edito dall’Associazione Piera Cutino di Palermo, a firma della dr.ssa Rosalba Di Marzo e della dr.ssa Santina Acuto, Dirigenti Biologhe presso l’Unità di Ricerca "Piera Cutino" - div. Ematologia II - Osp. V. Cervello - Palermo.

NEW YORK - PALERMO: GEMELLAGGIO TRA CENTRI DI RICERCA

Esperimenti di Terapia Genica nelle Cellule Staminali di Pazienti Talassemici

Per molti anni diversi laboratori hanno cercato una cura definitiva alla talassemia attraverso la terapia genica, vale a dire attraverso la correzione genetica delle cellule staminali del midollo osseo.

Ci sono parecchie ragioni per cercare quest’approccio. Prima di tutto, la B-talassemia, come tutti sanno, è un disordine genetico causato da numerose mutazioni, la maggior parte delle quali sono ora note, che provoca la mancata o diminuita sintesi dell’emoglobina. La seconda ragione è che il gene della B-globina è piuttosto piccolo, anche se complesso nella sua regolazione, ma oggi certamente ben conosciuto, e pertanto offre prospettive di successo nell’approccio genetico. La terza ragione è che non ci sono terapie che siano definitivamente curative da offrire ai pazienti affetti da questa malattia, se non il trapianto di midollo osseo da donatore.

Anche se questo trattamento può avere successo, c’è il rischio di serie complicanze immunologiche, inoltre è difficile trovare un donatore compatibile.

Nonostante nell’ultimo decennio si siano ottenuti enormi successi nel trattamento di questa malattia, grazie alle terapie trasfusionali e alla terapie chelanti (quelle che eliminano l’accumulo di ferro negli organi e nei tessuti dei politrasfusi); si tratta comunque sempre di terapie croniche, ben lungi dall’essere la cura definitiva.

Per questo motivo si sta cercando di prelevare le cellule dal paziente stesso, correggere il difetto genetico introducendovi il gene sano della B-globina, e poi reimpiantare definitivamente queste cellule nel paziente.

ALCUNI PROBLEMI

Per la realizzazione di questa procedura è necessario affrontare e risolvere alcuni problemi:

 Avere un metodo efficace e sicuro per l’introduzione del gene nelle cellule; per questo scopo oggi si usano esclusivamente vettori virali;
 Definire le cellule che devono essere geneticamente modificate; per la cura della B-talassemia queste cellule sono le cellule staminali del midollo osseo;
 Avere la certezza che i geni, una volta introdotti nelle cellule staminali, funzionino, sufficientemente per determinare un effetto terapeutico e correttamente, vale a dire siano attive solo nelle cellule eritroidi che generano i globuli rossi del sangue.

Per il trasferimento di geni nelle cellule umane, oggi si usano vari virus modificati mediante l’eliminazione delle sequenze patogene e resi incapaci di moltiplicarsi. Questi virus modificati sono definiti vettori virali.

Il vettore che ha dato migliori risultati per il trasferimento dei geni della B-globina è quello lentivirale.

Il prof. Sadelain che dirige il laboratorio di Genetica Umana presso il Memorial Sloan-Kettering Cancer Center di New York, ha sviluppato uno di questi vettori chiamato TNS9. Il DNA del vettore contiene pochissime sequenze virali poste ai lati, quelle indispensabili per ottenere il trasferimento, e nel mezzo contiene il gene della B-globina umana e tutte le sequenze necessarie per farlo esprimere adeguatamente.

Questo vettore è stato con successo introdotto nelle cellule staminali del midollo osseo di topi talassemici. Il modello del topo è utile per gli esperimenti di laboratorio, perché ha cellule staminali simili a quelle dell’uomo e produce il sangue con un processo simile al nostro. Il vettore TNS9 è stato in grado di produrre emoglobina umana nel topo talassemico, incrementando notevolmente la produzione d’emoglobina e quindi correggendo l’anemia.

I risultati di questi esperimenti, peraltro confermati da un altro gruppo di ricercatori statunitensi che hanno usato un vettore virale molto simile al TNS9, sono molto importanti perché dimostrano che la stesura di un protocollo clinico di terapia genica non è più una chimera com’era considerata qualche tempo fa.

DALL’ANIMALE ALL’UOMO

Per passare dagli animali di laboratorio all’uomo, il protocollo clinico dovrà ottenere l’autorizzazione dall’FDA (l’Autority che in America dà il via all’utilizzo dei nuovi farmaci e alla ricerca applicata ai pazienti). Dal punto di vista strettamente burocratico questa sarà la parte più difficile, perché l’FDA è poco incline a concedere autorizzazioni non supportate da ottimi risultati di laboratorio, e perché le richieste di documentare i passi della ricerca sono estremamente esigenti.

Prima di procedere a sperimentare sull’uomo sarà necessario riprodurre gli stessi esperimenti fatti sul topo, anche sui Primati non umani, cioè sulle scimmie.

Il prof. Sadelain ha già avviato, in collaborazione con un gruppo di ricercatori di Washington, gli esperimenti sulle scimmie. I risultati finora ottenuti si riferiscono al gene umano nelle cellule del topo, ma per quel che riguarda il gene umano nelle cellule umane, non abbiamo una risposta certa; per questo motivo è importantissimo avere anche un sistema che, in provetta, permetta di saggiare questo vettore nelle cellule dei pazienti.

Da cellule staminali del midollo osseo prelevato dai pazienti, è possibile riprodurre in provetta tutti i processi biologici di maturazione di queste cellule fino ad arrivare a produrre globuli rossi maturi. Questo sistema prende il nome di “coltura primaria eritroide in fase liquida” ed è già utilizzato nel nostro laboratorio.

Per questo motivo è stata avviata una collaborazione con il prof. Sadelain: abbiamo selezionato e congelato le cellule staminali del midollo osseo di quindici pazienti talassemici seguiti nel nostro Centro e di cinque donatori normali. Lo scorso gennaio ci siamo recate a New York presso il laboratorio del prof. Sadelain e abbiamo iniziato i primi esperimenti di trasferimento genico nelle cellule umane usando il vettore TNS9. Le cellule staminali di quattro campioni di pazienti e di due campioni di normale sono state “trasdotte” cioè sono state messe a contatto con il vettore in opportune condizioni. Dopo 24-48 ore queste cellule sono state cresciute in terreni particolari che determinano il loro differenziamento o in senso mieloide (cioè sviluppano le cellule bianche del sangue), o in senso eritroide (cioè vanno a terminale differenziamento fino a produrre globuli rossi).

PERCHE’ L’ESPERIMENTO

Lo scopo di questo esperimento è di dimostrare:

 Se è avvenuto il trasferimento del vettore all’interno delle cellule, cioè se il gene terapeutico si è inserito stabilmente nel loro DNA;
 Quanto questo gene sia in grado di esprimersi, cioè di produrre emoglobina;
 Se questo gene è espresso correttamente solo nelle cellule della linea rossa;
 Se è corretta l’anemia nelle cellule umane in coltura.

I risultati che abbiamo ottenuto hanno dimostrato che, in effetti, il vettore TNS9 è stato trasferito efficientemente nelle cellule staminali e si è inserito stabilmente nei cromosomi di queste cellule. Gli esperimenti sono ancora in corso per verificare se questo vettore si è espresso correttamente e se è stato in grado di correggere l’anemia; ma i primi risultati sono già molto promettenti.

Questi esperimenti sono stati possibili grazie alla disponibilità dei nostri pazienti talassemici che hanno accettato con grande entusiasmo di donare il midollo osseo.

Un sentito ringraziamento va anche all’Associazione Piera Cutino, alla Associazione Bambino Emopatico di Caltanissetta e alla Ditta ……… di Catania, per avere finanziato questo progetto.

Rosalba Di Marzo, Santina Acuto Dirigenti Biologhe presso l’Unità di Ricerca "Piera Cutino" Div. Ematologia II - Osp. V. Cervello - Palermo